Préparation Immuno

Immunoélectron microscopie

La réalisation d’un immunodétection en microscopie électronique nécessite une préparation spécifique, distincte de celle utilisée pour la microscopie ultrastructurale afin de ne pas dénaturer les épitopes. Il existe plusieurs stratégies de préparation : inclusion en résine avec immunodétection pré-enrobage ou post-enrobage, ou réalisation de coupes cryogéniques suivies d’immunodétection sur coupes (technique de Tokuyasu).

Dans tous les cas, la fixation initiale doit être beaucoup plus douce que celle utilisée pour la microscopie ultrastructurale, de manière générale les méthodes à base de paraformaldéhyde, contenant éventuellement un petit pourcentage de glutaraldehyde (<0,1%), utilisées pour la microscopie photonique conviennent. L’immunodétection n’est pas compatible avec le tétroxyde d’osmium ni aucune méthode de contraste post-fixation, ces étapes doivent donc être omise ou pratiquée après l’immunodétection

  • Pré-enrobage : l’immunodétection est réalisée après fixation comme pour de la microscopie photonique à l’exception du fait que l’anticorps secondaire est marqué à l’or. les échantillons sont ensuite traités comme pour l’ultrastructure. Cette technique est particulièrement indiquée pour observer des antigènes de surface ou des structures endocytées ou phagocytées, car elle permet de préserver au mieux l’ultrastructure mais les particules d’or colloïdal sont trop grosses pour pénétrer dans les tissus. Pour utiliser cette approche sur des structures internes il faut appliquer une technique de perméabilisation préalable (généralement traitement par un détergent) et des réactifs nanogold suivi d’une étape d’amplification à l’argent ou à l’or pour augmenter la taille des particules.

A noter : l’utilisation d’un agent perméabilisant induit une altération de l’ultrastructure.

  • Inclusion en résine hydrophile

La déshydratation n’est pas totale et les résines utilisée sont des résines hydrophiles, la plus courante étant le LR white. Les immunodétections sont réalisées sur les coupes à l’aide d’un réactif secondaire marqué à l’or colloïdal. En absence de tétroxyde d’osmium, le contraste n’est pas aussi bon que ce que l’on peut obtenir en ultrastructure et les tissus moins bien préservés. On peut également utiliser un anticorps secondaire bifonctionnel (nanogold, fluorescent) pour faire de la microscopie corrélative.

Une approche d’inclusion en PLT en utilisant l’AFS2 permet d’améliore la préservation des structures.

  • Technique de Tokuyasu

Cette méthode ne fait pas appel à de la résine. Les échantillons légèrement fixés sont cryoprotégés par infusion dans du sucrose, congelés dans l’azote, et coupés à froid. Les coupes congelées sont ensuite ramenées à T° ambiante et l’immunodétection est réalisée sur les grilles. Les échantillons sont ensuite fixés, contrastés et protégés par un film mince de methylcellulose contenant de l’acétate d’uranyle et séchés à l’air.

A noter : C’est la méthode permettant la meilleur préservation de l’architecture cellulaire native et de l’antigénicité des échantillons, elle est cependant délicate techniquement et offre peu de contraste.

Contact

Véronique Viguier
MEA
Université de Montpellier
Place E. Bataillon, Bât 24, cc 87
34095 Montpellier cedex 5 – FranceTel: 04 67 14 93 74
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Appareils Disponibles

Méthodes de préparation pour :

MET
MEB
Immuno