Pour la Microscopie Électronique en Transmission:
Les échantillons doivent être suffisamment minces pour être traversés par le faisceau d’électron. Le type de préparation va dépendre de la nature des échantillons, mais dans tous les cas la taille de l’échantillon sera limitée en épaisseur (20-100nm) et en surface (max 500 µm X 500 µm)
Particules de petite taille (<1 µm) :
L’échantillon peut être déposé directement sur une grille. S’il est naturellement opaque aux électrons (nanoparticules,…) il peut être observé directement. Dans le cas contraire, il doit être contrasté avant observation c’est la technique de coloration négative. C’est le plus souvent le cas pour les échantillons biologiques de petites taille (virus, exosomes, vésicules, organites purifiés…etc). L’agent contrastant utilisé est un élément à numéro atomique élevé qui peut être de l’acétate d’uranyle, de l’acide phosphotungstique, des lantanides…etc
Echantillon de grande taille :
Les échantillons de grande taille doivent être coupés sous formes de sections ultrafines pour pouvoir être observés.
- Matériaux durs : selon leur rigidité et leur degré de dureté, les matériaux peuvent être coupés à l’aide d’un couteau en diamant ou amincis à l’aide d’un l’amincisseur ionique. Les matériaux semi-rigides peuvent être sectionnés à froid en cryo-ultramicrotomie (-15°C à -150 °C).
- Matériaux mous : les matériaux mous doivent être coupés et observés à froid (porte-objet refroidi) ou être inclus en résine. Dans ce dernier cas les méthodes de préparation se rapprochent des techniques utilisées pour les échantillons biologiques.
- Echantillons biologiques : à de rares exceptions près, la plupart des échantillons biologiques doivent être inclus en résine pour pouvoir être sectionnés. Il existe de nombreux types de résine (epoxy, methacrylate, lowicryl…etc). Le principe de préparation suit le même schéma, le protocole sera choisi en fonction de la nature de l’échantillon, du type de structure recherché, du contexte expérimental…etc. Voir schéma 1
Schéma 1 : Préparation des échantillons pour la Microscopie ultrastructurale en transmission
L’étape de fixation initiale est cruciale pour le bon déroulement de la préparation, elle permet de figer les échantillons dans un état au plus proche des conditions du vivant. La fixation chimique est la plus facile à mettre en œuvre mais peut générer des artefacts. La cryofixation par congélation rapide permet de figer instantanément les échantillons hydratés dans un état très proche du vivant en vitrifiant l’eau des tissus en glace amorphe non-cristalline. A l’heure actuelle, nous pouvons réaliser la cryofixation d’échantillons de petite taille (<1 µm) par immersion dans l’éthane liquide. La cryofixation d’échantillons de plus grande taille (jusqu’à 200 µm) nécessite un congélateur à haute pression matériel qui n’est actuellement pas disponible à Montpellier.
La post-fixation a un objectif double: contraster les tissus en introduisant des métaux lourds et fixer les éléments qui sont mal fixés par les aldéhydes, notamment les lipides. Déshydratation et imprégnation peuvent s’effectuer à température ambiante, ou à froid en utilisant des résines compatibles avec les basses températures (HM20, K4M…etc) et l’AFS2. La technique à froid (PLT-progressive lowering température) permet de mieux préserver l’ultrastructure.
La cryosubstitution consiste à sublimer la glace amorphe après congélation rapide pour la remplacer par un solvant de substitution. L’intérêt est de ne pas passer par l’étape de déshydratation, elle aussi génératrice d’artefacts et d’altération des tissus. Elle dénature très peu les tissus et permet dans certains cas de préserver la fluorescence des échantillons étiquetés par une protéine rapporteuse dans la résine. C’est une étape essentielle pour mettre en œuvre une approche en microscopie corrélative (CLEM).
Méthodes de préparation pour :